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Transformación de bacterias

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2. OBJETIVO
Introducir ADN plasmídico en células de E.coli competentes


3. ALCANCE
Profesores y alumnos de formación profesional de grado superior
Estudiantes universitarios de grado y posgrado
Personal de laboratorios de biotecnología

4. REFERENCIAS
HANAHAN, D. (1985) Techniques for transformation of E.coli. En DNA cloning: a practical approach. D.M. Glover vol.I pp. 109-135, IRL Press, Oxford

5. DESCRIPCIÓN
5.1. FUNDAMENTO
Uno de los métodos más utilizados para obtener grandes cantidades de un plásmido consiste en introducirlo en células bacterianas, en lo que se denomina método de transformación.  Las bacterias que han incorporado el ADN plasmídico se denominan transformantes y si se reproducen en el medio adecuado, a partir de un gran número de transformantes se podrá recuperar un gran número de unidades del plásmido.
Para  introducir ADN plasmídico en células bacterianas se requiere tener una  preparación de células competentes, es decir, capaces de incorporar plásmidos, para lo cual se puede usar el método de Hanahan (1985).
En este método las células de E.coli se cultivan en medio LB hasta que alcanzan una densidad óptica  a 600 nm no superior a 0,6. Para hacerlas competentes se tratan sucesivamente con dos soluciones RF1 y RF2 y se almacenan a -70°C o -20°C hasta su utilización.
Para la transformación el ADN plasmídico se añade en una  proporción de 50 ng por  cada 2x108 células.
La selección de las células transformadas se realiza mediante crecimiento en un medio selectivo de acuerdo con el gen marcador presente en el plásmido introducido.
5.2. MATERIAL
MATERIALES
ADN plasmídico
Células de E.coli competentes
Tubos eppendorf
Tubos de tapón verde
Placas de Petri
Medio LB-líquido
Medio LB-agar con ampicilina
Micropipeta de 1-10 µl (p10)
Micropipeta de 20-200 µl (p100)
Puntas de micropipeta estériles transparentes (p10) y amarillas (p200)
Caja de polispam con hielo picado
Asa de vidrio acodada para siembra por extensión
Mechero Bunsen o de camping-gas
EQUIPOS
Congelador de -70°C o -20°C
Estufa de cultivo
Estufa de cultivo con agitación
Bloque térmico
Cabina de flujo laminar
Máquina productora de hielo
Microcentrífuga
Centrífuga para tubos de 10 ml

REACTIVOS

Ampicilina
Medio LB
Agar

DISOLUCIONES

AMPICILINA

Disolver 50 mg en 10 ml de agua milliQ, esterilizar por filtración y hacer alícuotas de 1 ml en tubos eppendorf. Mantener a -20°C hasta su utilización.

MEDIO LB

Disolver 1 g de triptona, 0,5 g de extracto de levadura, 0,5 g de NaCl y 40 µl de NaOH 5M en 100 ml de agua destilada y esterilizar en autoclave.

MEDIO LB AGAR CON AMPICILINA

Añadir 2 g de agar a 100 ml de medio LB antes de esterilizar en autoclave. Una vez esterilizado dejar que enfríe hasta 60°C y añadir ampicilina a una concentración final de 100 µg/ml.

5.3. PROCEDIMIENTO OPERATIVO
Añadir 1 µl de ADN plasmídico con gen de resistencia a ampicilina a un eppendorf con 200 µl de la cepa bacteriana de interés y agitar bien con una punta de  pipeta p200 (las alícuotas de E.coli deben mantenerse a -70°C hasta su uso, y durante su manipulación mantener los eppendorfs en hielo el mayor tiempo posible).
Mantener la mezcla en hielo durante 15 minutos.
Dejar 2 minutos en un bloque a 42°C (CHOQUE TÉRMICO) y pasar inmediatamente a hielo.
Añadir el contenido del eppendorf a un tubo de tapón verde con 2 ml de medio LB y poner a crecer con agitación a 37°C durante 1 hora aprox.
Centrifugar 2 minutos, despreciar el sobrenadante y pasar el tubo con el precipitado de células a hielo hasta el momento de plaquear.
Agitar el precipitado para disolverlo en las gotas remanentes del sobrenadante, ayudándose de la misma punta de pipeta (p200) que se usará para depositarlo sobre una placa de LB ampicilina.
Extender bien las células sobre la placa con ayuda de un asa acodada de vidrio previamente flameada.
Incubar a 37°C unas 16 h.
Las colonias que se obtengan serán de bacterias transformadas, puesto que sólo podrán crecer las células que hayan introducido el plásmido con el gen de resistencia a ampicilina.

6. TRATAMIENTO DE DATOS
No procede.

7. NOTAS DE SEGURIDAD Y MEDIO-AMBIENTE

En este procedimiento no se utilizan sustancias ni preparados de especial peligrosidad. Usar guantes, bata y gafas de seguridad en todo momento. Seguir las instrucciones de las etiquetas y FDS de los productos manipulados.

Los residuos sólidos, salvo las placas de Petri usadas, se recogerán en una bolsa y se tratarán como RSU convencionales. Las placas de Petri usadas se recogerán en bolsas de autoclave y se esterilizarán previamente a su tratamiento como RSU convencional.

Los residuos líquidos que hayan estado en contacto con muestras biológicas se recogerán todos juntos en un contenedor de plástico y se entregarán a la empresa gestora contratada para su tratamiento.

8. ANEXOS
No hay.

 

Last modified on dissabte, 29 de setembre de 2012 20:43
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